如何为您的实验选择最佳滤光片

　　滤光片可以成就，也能够破坏荧光显微镜实验。它们是每个荧光显微镜设置的关键组成部分，甚至有可能在最新 LED 显微镜照明提供的高速、高对比度成像方面取得突破。但是，最佳滤光片的选择和配置可能困难重重。在本白皮书中，我们将引导您找到问题的答案，帮助您为所需应用选择出最适合的滤光片。

　　您将了解：

　　如何为您的实验选择最合适的滤光片 ?

　　哪些 Pinkel 和 Sedat 配置可实现高速成像 ?

　　使用 LED 照明时有关滤光片的五个重要提示

　　在设计荧光显微镜实验时，为了获取高质量数据，科学家通常需要同时考虑光源、滤光片和荧光团的选择。我们的许多技术资源都集中在不同光源的特性与优势上，而本白皮书也将提供有关“为宽场荧光显微镜(widefield fluorescence microscopy)选择光学滤光片”的指导。

　　了解滤光片

　　一个标准的荧光显微镜装置通常包括三个装在荧光激发块(filter cube)中的组件——激发滤光片(excitation filter)、二色镜( dichroic mirror / beam splitter，也称为二向色滤光片)和发射光滤光片(emission filter)，如下图 1 所示：

　　激发滤光片——选择来自光源的光的波长以匹配荧光团的吸收光谱。

　　二色镜——选择并传输样本发出的荧光，并透射样品发出的较长波长。

　　发射光滤光片—— 仅选择与荧光团发射曲线相对应的波长，同时通过阻挡自发荧光、来自房间的杂散光或反射的 LED 光来增加对比度。

　　用于 GFP 成像的滤光片和光源。使用 CoolLED pE-100(蓝色图)的 470 nm LED 对 GFP 进行单波长成像，沿其激发光谱(浅绿色)激发 GFP。激发光路穿过激发滤光片(紫色)，低于 495 nm 的波长被分色镜(红色)反射到样品上。该能量被吸收并以荧光的形式释放，形成 GFP 发射光谱(深绿色)，二色镜(红色)将 495 nm 以上的光透射到检测器。背景噪声被发射光路中的发射光滤光片(黄色)进一步去除。

　　实验室有数以千计的滤光片和二色镜可供选择，而这种选择取决于单个荧光团和光源。滤光片的适用性主要取决于它阻挡或透射的波长，图 2 就是例子之一。它显示了 GFP 的光谱图，由 470 nm 的 LED 和优化的单波段滤光片组激发。

　　首先，我们可以看到 蓝色的LED 光谱与浅绿色 GFP 的吸收光谱重叠，因此光源与荧光团兼容。红色的二色镜反射波长小于 495 nm 的光，并将激发光路导向样品。在发射光路中，它会将 495 nm 以上的波长传输到检测器。这对于 GFP 而言是理想的，因为峰值吸收和发射之间发生了分裂，即 GFP 的相关激发波长被反射到样品上，且相关的发射波长到达了检测器。

　　紫色的激发光滤光片是专门用于传输 GFP 吸收光谱所需的 LED 的相关波长。请注意伸至 525 nm 的 LED“尾巴”：由于二色镜无法提供完美的分光，超过 495 nm 的某些波长会被反射到样品上，或反射到发射路径中并形成背景。但是，它会首先被激发滤光片阻挡，随后再被 GFP 吸收的能量以深绿色荧光发射的形式释放。在这种情况下，黄色的发射光滤光片会进一步阻挡来自 GFP 发射峰值范围之外的所有光。

　　多重荧光：如何通过滤光片来进行有效配置?

　　对单个荧光团进行成像相对简单，只需要在显微镜中安装一个荧光激发块。然而，在单个实验中捕获多个荧光团则需要额外考虑平衡速度、对比度和预算。

　　单波段滤光片——多个单波段荧光激发块(如图 1 所示)可被安装于电动显微镜滤光片转轮(motorised microscope filter cube turret)中，以实现高对比度成像，因为每个激发块都包含特定于各个荧光团的滤光片组。然而，激发块之间的切换速度很慢，将多标记样本的动态观察速度限制在秒级。

　　多波段滤光片——为了实现多个荧光团的同时成像，多波段滤光片选择性地传输/阻挡多个波长。然而，完整的多波段集可能会导致交叉干扰(cross talk / bleed through，即其中一个通道的发射通过另一个通道的二色镜和发射光滤光片传输)的对比度降低。通过在被称为 Pinkel 和 Sedat 的配置中组合单波段和多波段滤光片，研究人员能够有效减少渗透。

　　Pinkel 滤光片——这种配置使用带有多波段二色镜和多波段发射光滤光片的单波段激发光滤光片。通过利用 LED 照明系统的独立通道切换(如 CoolLED pE-800 系列)，其中单波段滤光片被安装于照明系统中(每个 LED 的前面)，可以在 <7 µs 的速度下进行顺序成像。然而，由于荧光团发射的广谱特性，在某些实验中，多波段发射光滤光片仍可能存在一些交叉干扰和对比度降低的风险 荧光团发射的性质

　　Sedat 滤光片——为避免交叉干扰，Sedat 滤光片配置使用与 Pinkel 类似的设置，但也使用单波段发射光滤光片。为了避免使用发射光滤光轮(emission filter wheels)(因为移动会引入延迟并限制成像速度)，一个聪明的技巧是：将图像分离器合并到发射光路中。它们将发射光路分成最多四个图像，并显示在相机芯片的不同区域(或不同的相机)，并容纳位于光路中的单波段发射光滤光片。这种设置结合了 Sedat 滤光片组的高对比度和 <7 µs LED 开关速度。

　　有关滤光片的重要提示

　　升级照明系统时，请检查您的滤光片：此前，滤光片是围绕汞和金属卤化物灯的辐照度峰值设计的。当与 LED 照明系统一起使用时，激发光滤光片的不良匹配会降低激发光辐照度，从而降低信号——这可能会影响图像质量并进一步影响数据的解释。若实验室升级光源，您需要重新考虑您的滤光片。实验室现在可以使用与 LED 兼容的滤光片，来匹配 LED 和流行荧光团的光谱。

　　LED 与激光(laser)不同：与激光相比，每个 LED 都具有更广的光谱，且可以使用滤光片定制以激发更广泛的荧光团。例如，若与适当的激发光滤光片一起使用，CoolLED pE-300 系列的蓝色 LED 可以激发 CFP、GFP 或 Ch2。

　　利用单个 LED 增强对比度：没有滤光片可以完全阻挡不需要的光。因此，与使用具有单独通道控制的 LED 照明技术相比，白光照明将导致更高的背景(因此对比度也更低)。

　　LED 需要激发光滤光片：即使仅使用相应的 LED 来激发荧光团， 每个 LED 光谱也都会有一个“尾巴”，如果不使用激发光滤光片来阻挡，它会导致背景噪声(如图 2所示)。

　　若您有特定的滤光片要求：滤光片制造商不会在其网站上列出所有滤光片，若您联系他们询问，他们很可能会为您提供适合您定制需求的滤光片。