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荧光显微镜滤光片

为何荧光显微镜需要使用滤光片

就荧光显微镜而言,激发滤光片、二向分色镜以及发射滤光片通常包含在同一立方体内,通常被设计来匹配特定荧光团或荧光蛋白的光谱。偶尔情况下,滤光片也可能不在立方体内,但会安装在一个转轮(称为滤光片转盘)上。滤光片转盘使您可以混合搭配尽可能匹配所需要的激发和发射波长。其终极目标是捕获到您希望从结合靶标的荧光基团束上捕获的光信号,同时漏过系统其他部分的任何光线(环境光、激发光源等)。我们在这里提到的出现在检测仪上不想要的光线被称为背景荧光.


荧光成像使用的滤光片的不同类型

通常情况下,滤光片组被设计成可用于捕获指定荧光团的最大激发和发射波长,但不会捕获所有的荧光。多数现代化滤光片组的设计旨在确保激发滤光片只允许指定波长区间的光线通过。这种类型的滤光片称为带通滤光片band-pass filter)。带通滤光片通常通过中间波长和区间宽度确定。在较为简单的荧光显微镜装置中,一旦激发光线离开激发滤光片,即会照射到靶标上,靶标上的荧光基团随即变为激发状态,然后发射向光谱的红外端(相对于激发光线)迁移的光线。并非所有此类发射光线都会被检测器捕获到——仅那些允许通过二向分色镜且能通过发射滤光片的光线。发射滤光片通常为带通滤光片或长通滤光片,具体取决于特定的荧光团和成像实验。如果您希望让超过特定波长的光线通过检测器,可选择长通滤光片.


激发滤光片
激发滤光片只允许荧光激发波长峰值附近的窄带波长通过。比如在右图中,黄色荧光蛋白(YFP)激发滤光片(MF469-16)透过率大于90%的通带是489505 nm;通带之外的入射光被部分阻挡(透射区域附近),或者被完全阻挡(远离带通波段)


二向色镜
二向色镜用来反射波长小于截止波长的光,透过所有其它的波长。在显微镜中,二向色镜将规定波长范围的光引导至样品和图像平面。二向色镜的截止波长是指透过率等于50%的波长。比如在右图中,黄色荧光蛋白(YFP)二向色镜(MD515)的截止波长约为515 nm。规格标签提供了每种二向色镜反射率和透过率≥90%的波长范围。

将一片二向色镜相对入射光成45°放在实验装置中,激发光(如右图中蓝线所示)在二向色镜的表面反射,然后通过物镜入射到样品上,而样品发射的荧光(如右图中红线所示)通过二向色镜,进入探测系统。

虽然二向色镜在荧光显微镜中起着至关重要的作用,但在阻挡不必要的光束时还不够理想;通常情况下,波长小于截止波长的光有大约90%被二向色镜反射,而波长大于这个值的光大约有90%透射。因此,部分激发光会和荧光一起透过二向色镜。为了阻止这种不必要的光到达探测系统,除了二向色镜还需要使用发射滤光片。


发射滤光片
发射滤光片能让样品产生的荧光到达探测系统,同时截止不必要的激发光。与激发滤光片类似,发射滤光片只允许荧光发射波长峰值附近的窄带波长通过。比如在右图中,黄色荧光蛋白(YFP)发射滤光片(MF535-22)透过率大于90%的通带是524546 nm;通带之外的入射光被部分阻挡(透射区域附近),或者被完全阻挡(远离带通波段)


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